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IVD企业必争之地“分子POCT”这是你知道的POCT吗?

POCT(Point-of-care Testing),又称为即时检测,其定义为在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。1995年POCT概念首次提出,POCT的出现能够在快速取得检测结果的同时免去了样本的处理和数据分析等繁琐的步骤,也不必再依赖于专业人员的操作,因此POCT 在医疗中的应用迅速增加,小至自我测试和门诊,大至重症监护病房,POCT 已应用在了各种医疗场合中。

世界卫生组织(World Health Organization,WHO)要求新建立的 POCT 方法应符合“ASSURED”标准,即经济实惠(Affordable)、灵敏度高(Sensitive)、特异性好(Specific)、操作简单(User-friendly)、快速并可重复(Rapid and Robust)、无需仪器(Equipment-free)和易获取(Delivered (to the end user))。该标准首次提出于 WHO 的热带疾病研究和培训特别项目(WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases),同时POCT 应在实验室和医院外由非实验室人员进行。

目前,POCT 不仅可用于血糖检测和早期妊娠的检测,还可用于心血管疾病、急慢性肾病、酸碱紊乱、感染性疾病、血液病、凝血功能障碍等方面的检测。常用的POCT技术早期主要以定性检测为主,包括胶体金、免疫层析、干化学技术等。后期随着技术的发展以及对检测结果需求的逐步提升,以免疫荧光、上转发光、化学发光、微流控技术等为核心的POCT产品快速发展并逐步应用于临床,实现了快速的定量检测,提高了准确性。

核酸分子检测方法??

核酸分子检测相对于抗原抗体检测在准确性、灵敏度、特异性方面具有明显优势。一场新冠疫情更是凸显了其在传染性疾病防控方面发挥着不可替代的作用。除了PCR之外,常见的核酸检测方式还有以下几种:

1、依赖核酸序列的扩增NASBA

1991年Jean Compton首次提出NASBA,该方法以单链RNA为模板,在41℃恒温条件下,通过逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物来模拟体内逆转录病的的复制机制进行目标RNA的扩增。90分钟内可以获得10的12次方倍产物,其产物长度在100到250个碱基,灵敏度最高达单个拷贝。

2、滚环扩增RCA

RCA是一种在37℃下进行的恒温扩增反应,具体过程为一条锁式探针与靶序列杂交后其在连接酶作用下连接成环,引物与环状模板匹配后在Phi29 噬菌体DNA聚合酶作用下沿环延伸并不停置换先前产生的互补序列,最终产生重复的长单链DNA。1小时内其单一引物可产生1000倍放大效果。在此基础上通过在产物上引入一至多条引物形成超支化RCA、将产物经限制性内切酶切割后再连接成环作为RCA模板、将产物重复片段切开后作为新的引物引发RCA扩增等手段均可实现RCA产物指数级的扩增。

3、环介导等温扩增LAMP

LAMP由Tsugunori Notomi等人于2000年首次发表,针对模板六个特异性区域设计的一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP在具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst ,LavaLAMP等)作用下沿模板发生延伸和置换的循环。在60~65℃条件下1小时内可以获得10的9次方倍的扩增产物,靶序列的最佳长度在130-200 bp,最佳灵敏度大于10拷贝。在此基础上,可以通过额外引入一对环状引物可显著提升其检测灵敏度并加速反应进程将时间缩短至30分钟内。可通过双链嵌合染料对其产物进行实时检测,经终点法琼脂糖凝胶电泳对其产物进行检测时其电泳条带呈梯形。后来又陆续开发出了多种LAMP检测方法如比浊法、钙黄绿素法、羟基萘酚蓝、pH响应显色、侧流层析等。

4、解旋酶依赖性扩增HDA

在体内,DNA通过解旋酶、DNA聚合酶及各种辅助蛋白因子进行复制,Vincent等人模仿这一过程开发出了体外的解旋酶依赖性扩增法。该方法原理,首先DNA双链被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分离为单链并分别被单链结合蛋白(SSB)结合,之后两条上下游特异性引物分别与模板杂交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的双链。在37℃条件下反应1-2小时可获得10的6次方倍的扩增产物,其靶序列在400 bp范围内可以得到有效扩增。后来有研究称可以将UvrD解旋酶与Bst-DNA聚合酶偶联构成一种双功能蛋白,可显著提升HDA反应速率,并可实现长达2.3kb的片段扩增。

5、重组酶聚合酶反应RPA

2006年Piepenburg等人首次介绍了RPA反应,目前该方法已有成熟商业化试剂盒推出市场。基础的RPA反应主要有三种酶参与,包括重组酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和单链结合蛋白(gp32)以及两条特异性的上下游引物。具体扩增机理如下,首先T4 uvsX在辅助因子uvsY的作用下与引物结合形成核酸蛋白复合物,之后该复合物寻找与靶标DNA的互补区域进行杂交并置换下另一条单链,该单链马上被gp32结合防止其再与互补链杂交。接下来与引物结合的T4 uvsX在ATP的作用下解离,引物在聚合酶Bsu作用下沿模板链延伸。该反应在37-42℃下反应,30分钟内可以获得10的12次方倍拷贝的扩增产物。其扩增长度在500bp以内最佳。

平台类型??

标准分子生物学实验室具有严格的功能分区,包括核酸提取区、试剂准备区、扩增区及产物分析区,qPCR的发展应用可使扩增区与产物分析区合并,但仍然需要较大的实验室空间,而且对实验室的通风条件、负压条件及样本与人员流动方向都具有一定的要求。除了实验室条件外,分子实验的操作及结果的判读分析也具有一定的专业性,需要投入较大人力。使得常规的分子生物实验室的设立具有较高门槛,难以在各级诊疗机构全面开展。面对各级医疗机构对于核酸检测的需求甚至个人自测的需求,各式的核酸检测POCT产品应运而生。受最适的应用场景、检测通量、检测成本的影响,不同厂家在开发分子POCT平台时具有不同的侧重点,因此所呈现的最终的产品形态也是百花齐放。

1、无仪器分子POCT

如Lucira Health新冠试剂中的检测单元组件包含多个反应腔室,可检测新冠N基因的两个非重叠区域,同时设置有一个阳性内部质控(Positive Internal Control, PIC)和一个裂解内部质控(Lysis Internal Control, LIC)。采集样本后的拭子在样本管洗脱液作用下,于室温裂解释放核酸;核酸进入检测单元的不同反应腔室,执行RT-LAMP反应;反应过程会导致体系pH值改变,并可通过显色剂呈现出颜色变化;检测单元内置的光电元件实时检测反应体系的颜色变化,从而对检测结果进行判读;由于反应过程是实时检测的,阳性结果可在11分钟内显示、阴性或无效结果则需在30分钟后显示。

2、微流控分子POCT

博奥将微流控技术与恒温扩增技术完美结合,满足当前临床诊断、食品安全等快检领域高通量、经济、高效的需求。最快 20 分钟即出结果,与 PCR 多孔板扩增相比,反应体系小,操作更简便,灵敏度可达10-1000拷贝。

3、自动化分子POCT

Automolec 3000,不仅把核酸提取、纯化、扩增、检测集成到了一台机器上,还做到了“样本随来随检”。突破了以前高通量一体机只能按批量检测的限制, 单个样本随来随检,首个结果100分钟,之后2分钟出一个结果,可实现200测试/8小时,多项目同时载机测试,适用多样本类型。

分子POCT上游组件??

为实现上述各种形态的POCT产品,需要依托完整的工业体系,包括电子信息、机械工程、微流体通路设计、光学设计等,此外还有材料、化学、生物等的支持。

液路模块是分子POCT产品最具挑战的核心技术之一,常见的有管式、卡盒式、盘式、以及微流控芯片式。其中微流控芯片更是对当前最先进工艺的整合,其基质从无机材料到有机材料均有覆盖。而不同材料所制备的芯片往往适用于不同功能的生化分析需求。同时,不同材质在加工方面的难易程度也成为人 们选择芯片基质的一个重要原因。最初的微流控芯片基质是半导体行业中所常用的硅片,可通过干法刻蚀或湿法刻蚀进行加工成型,在硅片表面形成不同的通 道与分区来实现不同功能。虽然硅片不具透光性,导致多数基于光学的生化分析或荧光成像检测难以应用于硅质芯片,但是可通过在芯片特定结构部分添加金属相来进行电化学检测,或者与透明材质如玻璃的混用来解决光学检测的问题。

由于玻璃具有良好的光透过性,具有很低的荧光背景,而且可通过硅羟基在玻璃表面轻易进行多种修饰改性,因此玻璃逐渐替代硅成为主要的无机硬质微流控芯片材质,同样可采用湿法刻蚀或干法刻蚀进行微结构的加工。但是无论是以硅还是玻璃作为芯片的基质,其加工制作工艺难度相对较大,需要大型仪器设备,成本较高,并不利于一次性检测芯片的推广应用,而且开发准入门槛较高,也限制了其发展。因此更多的实验室将芯片的研发聚焦于有机材料如 PDMS,此类材料借助阳模可直接注塑成型,能够显著降低单个样本的检测成本。

生物制剂则是液路系统之外另一核心技术。不同于常规分子诊断试剂,为了适配POCT的需求,反应所需的生物酶、dNTP、盐离子缓冲介质等往往需要预载到卡盒或芯片的个功能腔室内,而预载试剂的卡盒由于具有较大体积,且受卡盒基质、预载试剂的多样性如磁珠等特性的影响,以及储存运输成本的限制,一般需要进行4℃或常温存放,这就对试剂的稳定性和耐热性提出了严格要求。

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